發(fā)酵微生物在發(fā)酵食品物理化學(xué)和感官特性方面起著關(guān)鍵作用。它們也與食品安全相關(guān)，因?yàn)樾枰拗撇≡⑸锖臀⑸锏纳L。因此，細(xì)胞活力的評(píng)估對(duì)于發(fā)酵食品工業(yè)（特別是乳品部門）通常是非常重要的。由于發(fā)酵微生物與食品的感官特性密切相關(guān)，因此需要有能力判別細(xì)胞的分裂能力，而且需要確定其代謝活動(dòng)和適應(yīng)性，以改善質(zhì)量控制和終產(chǎn)品。對(duì)于益生菌產(chǎn)品，若要對(duì)健康產(chǎn)生益處，則還需要確保存在足夠數(shù)量的活細(xì)胞。

已有一些方法用來分析參與發(fā)酵過程的微生物種群的特征。傳統(tǒng)是采用描述性的培養(yǎng)方法，它仍然是確定菌落（即可培養(yǎng)細(xì)胞）存在與否及其數(shù)量的常用的方法。然而，這些簡(jiǎn)單的方法在微生物種群生理狀態(tài)方面也存在一定的偏差，特別是其中共存幾個(gè)不同生存活力和代謝活性的亞群。于是又誕生了一些分子技術(shù)，能夠描述微生物中間狀態(tài)，以及通過標(biāo)志物定量來判定菌群健康程度及新陳代謝活力的方法，而非僅僅對(duì)其生長和不生長進(jìn)行定量。分子方法包括熒光原位雜交、流式細(xì)胞術(shù)、組學(xué)及PCR技術(shù)。PCR技術(shù)已在常規(guī)得到引用。

培養(yǎng)法是傳統(tǒng)常用的方法，其局限是缺乏目標(biāo)菌和伴隨菌之間的鑒別、得出結(jié)果的時(shí)間、假陽性計(jì)數(shù)、食品基質(zhì)影響、存在一些活而不可培養(yǎng)的細(xì)胞（簡(jiǎn)稱VBNC）（即垂死細(xì)胞）。VBNC是上世紀(jì)80年代才認(rèn)識(shí)到的，因而用活/死細(xì)胞染色檢測(cè)試劑盒或RT-PCR來鑒別細(xì)胞是能分裂、還是VBNC，或死亡?，F(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，在活細(xì)胞和死細(xì)胞之間，存在許多中間狀態(tài)。而培養(yǎng)法產(chǎn)生的細(xì)胞對(duì)應(yīng)的都是能分裂的細(xì)胞。

而人們對(duì)培養(yǎng)法仍然注入了許多興趣，培養(yǎng)基得到了改進(jìn)和發(fā)展，例如用于益生菌和非益生菌的選擇性計(jì)數(shù)，酸奶、奶酪和發(fā)酵劑中雙歧桿菌的選擇性計(jì)數(shù)等。使用不同的瓊脂平板培養(yǎng)基，可以對(duì)許多商品進(jìn)行益生菌存活率的評(píng)估。這些商品包括濃縮粉、冷凍材料、膠囊、食品和飲料等。可以確定保證活菌低數(shù)量的益生菌效期。酸奶和奶酪中益生菌存活的影響因素也得到了研究。但由于培養(yǎng)法也存在一些不足，因此推薦同時(shí)采用分子鑒定的手段進(jìn)行驗(yàn)證，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。這對(duì)于益生菌計(jì)數(shù)尤為重要，因?yàn)橐ＷC必要的數(shù)量。

圖2. HiMedia公司生產(chǎn)的乳桿菌顯色培養(yǎng)基（品名，HiCrome™ Lactobacillus Selective Agar Base，貨號(hào)M2065，需添加劑FD345），用于乳桿菌的分離和內(nèi)部鑒別。嗜酸乳桿菌菌落淡粉色-粉色，鼠李糖乳桿菌菌落為淡綠色，發(fā)酵乳桿菌菌落為黃色，胚牙乳桿菌菌落和乳酸乳球菌乳酸亞種菌落均為淡綠色-綠色（光暈）

圖2. HiMedia公司生產(chǎn)的雙歧桿菌顯色培養(yǎng)基(品名：HiCrome™ Bifidobacterium Agar，貨號(hào)M1960)，用于雙歧桿菌和乳桿菌之間的鑒別。嬰兒雙岐桿菌菌落為深藍(lán)色至藍(lán)綠色，短雙歧桿菌菌落為粉紅色（有光暈），植物乳桿菌菌落為綠色（有霧狀背景），發(fā)酵乳桿菌菌落為粉色無光暈。

用于致病菌分析的顯色培養(yǎng)基也發(fā)展起來了，并進(jìn)行了驗(yàn)證和標(biāo)準(zhǔn)化。的確，李斯特菌、沙門菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌及其他腸道菌可通過大量顏色鑒別出來。顯色培養(yǎng)基使用方便，不需要分子生物學(xué)方面的知識(shí)。這在乳品微生物質(zhì)控方面，無疑非常重要。其發(fā)展對(duì)彌補(bǔ)特異方法的不足也有幫助。

鏡檢、流式細(xì)胞術(shù)和其他熒光標(biāo)記方法是否適合食品企業(yè)？將熒光原位雜交（FISH）用于乳品微生物計(jì)數(shù)已有數(shù)篇報(bào)道，例如奶酪中的丙酸桿菌檢測(cè)和計(jì)數(shù)。FISH具有高特異性，可觀察細(xì)菌在環(huán)境中的空間分布。FISH的不足是可重復(fù)性低，容易有假陽性和干擾，因而用于常規(guī)分析較為困難。流式細(xì)胞術(shù)（FC）可用于單細(xì)胞分析，能鑒別各種VBNC和生理狀態(tài)。FC已成為有前景的標(biāo)記計(jì)數(shù)，并在食品微生物學(xué)領(lǐng)域已有許多報(bào)告。一些熒光染料針對(duì)細(xì)胞某些組分（如核酸、蛋白質(zhì)、脂類）、細(xì)胞內(nèi)pH值、膜完整性和細(xì)胞內(nèi)離子、活力標(biāo)志物和膜能量狀態(tài)。也可采用幾種染料同時(shí)進(jìn)行分析。一些學(xué)者用FC研究了食品生產(chǎn)或存儲(chǔ)過程中遇到的酸、氧化、滲透壓、冷應(yīng)激對(duì)微生物細(xì)胞狀態(tài)的影響。批次培養(yǎng)的群體動(dòng)力學(xué)、細(xì)菌噬菌體感染的早期檢測(cè)、奶酪加工溫度導(dǎo)致的膜變化以及抗生素效應(yīng)也得到了研究。FC也被建議用于益生菌活菌計(jì)數(shù)。在細(xì)菌指數(shù)生長期，F(xiàn)C計(jì)數(shù)和平板計(jì)數(shù)的一致性得到了確認(rèn)。其他情況下，F(xiàn)C計(jì)數(shù)超過平板計(jì)數(shù)0.3–1的對(duì)數(shù)數(shù)量級(jí)(CFU/g)。FC所需的分析時(shí)間更短，且可自動(dòng)化。但FC無法區(qū)分屬和種，且檢測(cè)閾值較高，在牛奶中達(dá)到103 –104細(xì)胞/ml。

FC也需要一些經(jīng)驗(yàn)，并且有時(shí)存在假陽性。

盡管如此，F(xiàn)C仍然是食品工業(yè)有前景的分析工具。除了計(jì)數(shù)簡(jiǎn)單外，F(xiàn)C也能提供更多細(xì)胞活力的相關(guān)信息。它有益于益生菌產(chǎn)品的質(zhì)控。2005年，ISO發(fā)布了ISO 19344:2015，推薦了用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定與牛奶和奶制品相關(guān)的發(fā)酵劑、益生菌和發(fā)酵制品中乳酸菌的數(shù)量。

測(cè)序和組學(xué)的技術(shù)也發(fā)展起來，用于研究乳酸菌對(duì)環(huán)境的反應(yīng)。組學(xué)也用于鑒定關(guān)鍵標(biāo)志物，以篩選新的益生菌，并評(píng)估其生理狀態(tài)。使用組學(xué)技術(shù)可理解微生物行為和細(xì)胞通路，以優(yōu)化工業(yè)生產(chǎn)過程。

在食品工業(yè)，PCR已成為檢測(cè)致病菌的常規(guī)方法，得到了ISO的認(rèn)可，并發(fā)展為熒光定量PCR。這些來自比較基因組學(xué)的分析，被用于微生物群體定量、乳制品加工中微生物角色評(píng)估或同時(shí)鑒定乳酸菌和益生菌的多個(gè)菌種。PCR也用于評(píng)估食品加工過程中微生物的生理狀態(tài)和活力。有一種區(qū)分活菌和死菌的方法是進(jìn)行針對(duì)RNA而非DNA的RT-qPCR，但該方法仍然需要標(biāo)準(zhǔn)化。另外一種PCR方法是采用DNA嵌合染料PMA和EMA。它們只進(jìn)入死細(xì)胞，能阻止DNA的PCR擴(kuò)增。采用PMA-PCR和EMA-PCR進(jìn)行益生菌產(chǎn)品中的活菌計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與平板計(jì)數(shù)一致性良好。

總之，目前人類對(duì)于發(fā)酵菌的生物學(xué)知識(shí)有助于開發(fā)基于菌株特異性生化反應(yīng)的顯色培養(yǎng)基。這些顯色培養(yǎng)基比傳統(tǒng)培養(yǎng)基更具有鑒別力，更為特異，有助于乳品工業(yè)的微生物控制。流式方法對(duì)分析乳品、酸奶和其他發(fā)酵乳中的混合菌群很有前景，可用于質(zhì)控和產(chǎn)品保質(zhì)期的研究。但它需要優(yōu)化，并需去除乳蛋白。不論何種方法，都需與標(biāo)準(zhǔn)方法驗(yàn)證，并須進(jìn)行方法學(xué)上的評(píng)估，以與乳制品企業(yè)的特定需求相一致。

參考文獻(xiàn)

Danièle Sohier, et al. Evolution of microbiological analytical methods for dairy industry needs. Frontiers in microbiology. 2014, 5: 16

HiMedia公司是微生物培養(yǎng)基生產(chǎn)商，其顯色培養(yǎng)基有80多種，涵蓋各個(gè)領(lǐng)域，包括無動(dòng)物源成分及化學(xué)限定。其生產(chǎn)工藝具有WHO-GMP、ISO9001和ISO13485質(zhì)量體系認(rèn)證認(rèn)證，產(chǎn)品有CE和FDA注冊(cè)登記，其產(chǎn)品行銷140多個(gè)國家。