無(wú)論是歐洲藥典、日本藥典、還是中國(guó)藥典，均對(duì)細(xì)胞相關(guān)的臨床項(xiàng)目有明確的支原體檢測(cè)指標(biāo)的要求。藥典中還指出，核酸法經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證后，可替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法與指示細(xì)胞法進(jìn)行檢測(cè)。

PART.01

qPCR檢測(cè)支原體的技術(shù)原理

通過(guò)擴(kuò)增高度保守的rRNA操縱子，或者更準(zhǔn)確地說(shuō)，擴(kuò)增支原體基因組中的16S rRNA編碼區(qū)，可以特異性地檢測(cè)支原體。在FAM通道檢測(cè)支原體特異性擴(kuò)增片段。在HEX通道檢測(cè)內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照的擴(kuò)增。它能特異性檢測(cè)所有導(dǎo)致細(xì)胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會(huì)被擴(kuò)增。通過(guò)內(nèi)部對(duì)照，可檢測(cè)PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結(jié)果。

樣本通常為細(xì)胞培養(yǎng)上清液，如檢測(cè)其他組織或細(xì)胞樣本，需要對(duì)樣本進(jìn)行額外的處理，例如蛋白酶消化等過(guò)程。檢測(cè)程序通常可在3小時(shí)內(nèi)完成。

PART.02

qPCR用于支原體檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)

快速簡(jiǎn)便

與動(dòng)輒30天起步的傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，qPCR技術(shù)的反應(yīng)時(shí)間相對(duì)較短，通常在幾小時(shí)內(nèi)就可以完成，大大縮短了用于檢測(cè)對(duì)的時(shí)間成本。

靈敏度高

qPCR技術(shù)可以在非常低的病原體濃度下進(jìn)行檢測(cè)，這種高靈敏度使得qPCR能夠有效地檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)體系、實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)流程中，是否發(fā)生支原體污染，即使在污染的早期階段，也能夠得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

并且配合靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行靈敏度的驗(yàn)證，進(jìn)一步完善方法學(xué)驗(yàn)證的流程。

以德國(guó)Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例，檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

特異性強(qiáng)

qPCR技術(shù)可以使用特異性引物和探針來(lái)選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo)支原體的DNA序列。通過(guò)設(shè)計(jì)引物和探針與目標(biāo)序列高度匹配，可以避免非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高檢測(cè)的特異性。

以德國(guó)Minerva Biolabs公司的Venor Gem qEP為例，一次檢測(cè)即可涵蓋所有常見(jiàn)易感染細(xì)胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細(xì)菌和真核DNA無(wú)交叉反應(yīng)。

定量能力

與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，qPCR可以提供定量信息。通過(guò)利用熒光探針或DNA染料，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)過(guò)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而得到目標(biāo)序列的定量結(jié)果。這種定量能力使得qPCR技術(shù)在支原體載量的測(cè)定和污染進(jìn)程的監(jiān)測(cè)中非常有用。

PART.03

支原體檢測(cè)試劑盒

德國(guó)MB公司生產(chǎn)的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒（均為探針?lè)z測(cè)）：Venor Gem qEP，有以下優(yōu)點(diǎn)：

①遵循歐洲藥典流程要求

②高特異性。一次檢測(cè)即可涵蓋了所有可能感染細(xì)胞的支原體物種（涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體），根據(jù)序列一致性，至少可以檢測(cè)到107種支原體物種。操作簡(jiǎn)單，易于觀察（使用MB的試劑盒，多種支原體物種均為陽(yáng)性，其他微生物或真核細(xì)胞均為陰性，無(wú)交叉反應(yīng)）。

③高靈敏度。MB公司的支原體qPCR檢測(cè)試劑盒經(jīng)典法檢測(cè)限可達(dá)到≤10CFU/ml。

④各類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品配套齊全

10CFU/100CFU的敏感度測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)品，便于方法學(xué)驗(yàn)證。

支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測(cè)。